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如何知道回輸的細胞產品濃度和活率?
來源:本站整理 | 發布時間:2023-04-13 | 瀏覽:270次 【關閉此頁

近年來,細胞治療已經成為一種非常有前景的治療手段,在臨床應用方面顯示出巨大的應用潛力。細胞治療包括免疫細胞治療和干細胞治療。細胞產品被稱為“活”的藥物,制備流程復雜,質量控制貫穿研發到臨床的各個方面。

國家藥品監督管理局藥品審評中心發布的《人源性干細胞產品藥學研究與評價技術指導原則(征求意見稿)》和《免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則(試行)》中都指出細胞計數和活率是評價細胞產品的基礎和重要指標。因此,需要建立準確的細胞計數及活率檢測方法,并建立產品的放行標準。


雖然現在有很多自動化細胞計數儀,但人工計數仍然是最簡便易行的方法且被廣大實驗室使用,大部分智能化的計數儀器所采用的基本原理還是與血球計數板方法一樣。儀器只對“標本”負責,上機前仍需要規范的細胞樣品準備和加樣過程。


1

鏡檢法(血球計數板)

自18世紀以來,使用血球計數板進行顯微鏡計數,一直被認為是細胞計數的“金標準”。采用標準化的步驟實現單個細胞計數,從而計算細胞的濃度。通過添加臺盼藍染料來確定細胞活率。

血球計數板法為經典的細胞計數方法,可以在不同的情況下具有多功能和適應性。在顯微鏡下直接測定,操作便捷,成本低,可較為準確了解細胞狀態。但是,樣品中有較多雜質、碎片時,易被計算在內,導致結果偏高。該方法受主觀因素影響較大,對操作人員的經驗及操作熟練度有一定要求,不適合多樣本、連續檢測。

2

圖像分析法

圖像分析法是目前主流的細胞計數法,包括臺盼藍染色法和雙熒光染色法,檢測原理是基于活細胞細胞膜是完整的。圖像分析法可以自動拍照和數據分析統計,適應性強,適用于幾乎所有類型細胞的檢測。

▉ 臺盼藍染色法

正常的活細胞,胞膜結構完整,能夠排斥臺盼藍,細胞不被染色。而死細胞的胞膜不完整,通透性增加,可使臺盼藍滲入將細胞染成藍色。因此,借助臺盼藍染色可以簡單、快速地區分活細胞和死細胞。

臺盼藍染色法操作簡單,但其檢測原理有一定局限性:

1)細胞活率低于80%時,碎片、雜質、臺盼藍結晶等會干擾計數結果;

2)臺盼藍染料有毒性,染色時間過長會降低細胞活率,不宜超過5min。

▉ 雙熒光染色法

基于細胞核酸染料的雙熒光染色法如AO/PI染色法。AO可以通過完整的細胞膜嵌入活細胞的細胞核,呈現綠色熒光,PI只能通過死細胞的細胞膜嵌入細胞核,呈現紅色熒光。兩種染料在細胞核內發生能量共振轉移,致活細胞在藍色通道下激發出綠色熒光,死細胞在綠色通道下激發出紅色熒光。

雙熒光染色法操作簡單,不受細胞狀態、細胞碎片、背景雜質、無核細胞等干擾。但用于團聚細胞的檢測,染色效果對結果影響較大。

3

 電阻抗法

根據脈沖大小分析細胞體積,判定細胞死活,適用于標準顆粒計數或者細胞形態及大小規整的傳代細胞計數。

雖然可以進行細胞的絕對計數、且重復性較好。但是,電阻抗法不能檢測細胞活率,無法觀察到細胞狀態,且易受細胞雜質、雜質、氣泡等影響。


4

流式細胞術

結合熒光染料和分析軟件,實現流式細胞儀對單個細胞熒光信號進行濃度、活率、分型等檢測,常用于對混合培養的不同種類細胞進行分群。

流式細胞術操作相對復雜,對人員要求要高,無法直接觀察到細胞狀態,易受細胞碎片、雜質等影響,所測濃度和活率誤差較大。因此,一般不用于細胞計數,多用于細胞群分析,且檢測成本較高。


綜上,標準化的手動操作步驟、穩定的設備性能測試、準確的細胞識別參數設置、多人多次測試等,對于細胞濃度和活率檢測結果的準確性和一致性至關重要。


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